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【特集】タンパク質生産と溶解性制御
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網羅的解析によるタンパク質凝集特性とシャペロン機能の解明
Comprehensive Analyses of Protein Aggregation and Molecular Chaperones
-------------------------------------------------------------------------
丹羽達也(東京工業大学 大学院生命理工学研究科 助教)
田口英樹(東京工業大学 大学院生命理工学研究科 教授)
タンパク質の凝集形成はありふれた現象であるが,どんなタンパク質が凝集しやすい
か,どのシャペロンがどんなタンパク質の凝集を抑制するかについてはよくわかっていな
い。本稿ではシャペロンを含まない無細胞タンパク質合成系を用いて数百・数千種類のタ
ンパク質を一様に調べることでみえてきたタンパク質の凝集性とシャペロンの効果につい
て解説する。
【目次】
1.はじめに
2.再構築型の無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質凝集の網羅解析
3.主要な分子シャペロンによるタンパク質の凝集抑制効果の網羅解析
3.1 DnaKJE,GroEL/ES は様々な種類のタンパク質に作用
3.2 DnaKJE,GroEL/ES の「好み」の違いと重複性
3.3 複数種類のシャペロンを共存させた場合の凝集抑制効果
-------------------------------------------------------------------------
ペプチド系溶解性向上タグ「SEP タグ」を用いたタンパク質の凝集の解析および制御
Controlling and Analyzing Protein Solubility Using SEP-Tags
-------------------------------------------------------------------------
黒田 裕(東京農工大学 大学院工学研究院 生命機能科学部門)
溶解性はタンパク質の重要な性質であるが,その物理化学的な解析はほとんど進められ
ていない。本稿ではタンパク質の溶解性を親水性・疎水性と異なる視点から議論し,アミ
ノ酸の相対的な溶解性(溶解傾向性)の測定について述べる。さらに,溶解傾向性を用い
た低分子量のペプチド系溶解性向上タグ(SEP タグ)の設計と,その応用例を紹介する。
SEP タグは,タンパク質の構造および活性を害することなく,溶解性のみを制御するこ
とができる汎用的な技術として実用化が期待される。
【目次】
1.はじめに
2.アモルファス凝集の物理化学的解析
2.1 アミノ酸の溶解傾向性とタンパク質の溶解性の研究
2.2 SEP タグ付加による溶解性・凝集性の測定
3.SEP タグを用いた溶解性制御の応用例
3.1 封入体形成防止
3.2 NMR 試料の高濃度化
3.3 SEP タグによる複数SS 結合を形成する組換えタンパク質の収率向上
4.おわりに
-------------------------------------------------------------------------
タンパク質の溶解性を操るタンパク質カチオン化技術
Manipulation of Protein Solubility by Protein Cationization Techniques
-------------------------------------------------------------------------
二見淳一郎(岡山大学 大学院自然科学研究科 化学生命工学専攻 准教授)
ヒト細胞内タンパク質など不安定で凝集しやすい物性のタンパク質の取り扱いは容易で
はない。変性タンパク質の凝集と不溶化の主因は分子間の疎水相互作用とSS 結合の形成
であるが,これを解決するカチオン化法は,変性状態のタンパク質を水溶性として自由自
在に取り扱うことを可能とする技術である。
【目次】
1.はじめに
2.変性タンパク質の溶解性:疎水性と電荷の関係
3.変性状態のタンパク質のカチオン化による可溶化
4.変性状態のカチオン化タンパク質の活用法
5.可逆的変性カチオン化タンパク質のin cell folding 法
6.おわりに
-------------------------------------------------------------------------
難水溶性分子の溶解性を改善するアルギニン
Arginine Improves Solubility of Water-insoluble Molecules
-------------------------------------------------------------------------
井上直人(筑波大学 大学院数理物質科学研究科)
白木賢太郎(筑波大学 数理物質系 准教授)
アルギニンは低分子化合物からタンパク質まで,さまざまな分子の溶解性を改善するこ
とが知られている。しかもアルギニンは,安定で安全で安価な,ありふれたアミノ酸の一
種である。本稿では,バイオテクノロジーや基礎科学,医用などへのアルギニンの応用例
について紹介する。
【目次】
1.はじめに
2.難水溶性化合物の溶解性
3.タンパク質の溶解性
4.高濃度のタンパク質溶液
5.アルギニンの分子機構
6.おわりに
-------------------------------------------------------------------------
新規巻き戻し法による標的タンパク質の調製―完全変性を経由しない巻き戻し法―
Direct Protein Preparation from Inclusion Bodies Bypassing Completely-denatured Form
-------------------------------------------------------------------------
梅津光央(東北大学 大学院工学研究科 准教授)
谷 泉(東北大学 大学院工学研究科 客員教授)
不溶性顆粒からタンパク質を再活性させるためには,完全変性の状態で可溶化させた後
に天然構造へ誘導させる必要がある。筆者らは,大腸菌発現で形成した不溶性顆粒中には
天然構造に類似な巻き戻り中間体が存在することを突き止めた。本章では,その中間体構
造を利用したタンパク質再活性法を紹介する。
【目次】
1.はじめに
2.不溶性顆粒中のタンパク質は構造をとっていないのか?
3.フォールディングを壊さずに可溶化できるか?
4.フォールディングを壊さずに可溶化できるか?―L-アルギニンの利用―
5.ダイレクトタンパク質調製法の最適化と汎用性
6.さいごに
-------------------------------------------------------------------------
共発現による封入体化発現法を用いた組換えペプチド生産
Production of Recombinant Peptides as Inclusion Body by Coexpression
-------------------------------------------------------------------------
相沢智康(北海道大学 大学院先端生命科学研究院 准教授)
組換えペプチドの生産を効率的に行うことは,研究から産業応用までの幅広い分野で重
要な課題である。本稿では,共発現により効率的に封入体形成を促進する手法により,分
解や毒性を回避して効率よく組換えペプチドを生産する手法について,抗菌ペプチドの生
産を例として紹介する。
【目次】
1.はじめに
2.抗菌ペプチドの組換え生産の問題点
3.封入体形成パートナータンパク質との共発現によるペプチド生産
4.まとめ
-------------------------------------------------------------------------
封入体タンパク質の高効率回収および活性化技術の開発
Novel Method for Highly Efficient Production and Refolding of
Recombinant Proteins from Bacterial Inclusion Body
-------------------------------------------------------------------------
笹平 俊(松本微生物研究所 研究開発担当 専務取締役)
遺伝子組換え大腸菌の発現系を用いて,ブリ成長ホルモン(ブリGH)の生産,封入体
の回収,巻き戻しについて検討した。ブリGH 封入体は培養液1 L 当たり約150mg 生産
され,それから130mg 弱の活性型ブリGH が得られた。これは,従来技術の100 倍以上
の生産量であると共に,本方法は他の封入体タンパク質の可溶化や活性化にも応用できる。
【目次】
1.はじめに
2.組換え大腸菌が生産した封入体の回収方法
2.1 弊社での組換え体の作製・評価
2.2 ブリGH の遺伝子を組み込んだ組換え大腸菌の作製
2.2.1 ブリGH 遺伝子の合成
2.2.2 大腸菌への組込み
2.2.3 組換え大腸菌により生産された目的タンパク質の発現の確認
2.2.4 超音波破砕装置による菌体破砕と菌体由来タンパク質の除去効果
2.2.5 変性剤処理による封入体タンパク質の回収効果
3.リフォールディング方法の開発
3.1 従来技術
3.2 弊社が開発した高効率リフォールディング技術によるリフォールディング
3.2.1 変性剤の選定
3.2.2 開発透析装置による可溶化GH からの巻き戻し反応の効率化
3.2.3 タンパク質量と回収率
3.2.4 前処理およびリフォールディング条件の最適化によるGH の精製
3.2.5 ブリGH 以外のタンパク質生産
4.今後の展開
-------------------------------------------------------------------------
BIOR&D
-------------------------------------------------------------------------
酵母-乳酸菌複合バイオフィルムの特性と利用
Yeast-Lactic Acid Bacteria Mixed-species Biofilm:Properties and Application
-------------------------------------------------------------------------
森永 康(日本大学 生物資源科学部 食品微生物学研究室 教授)
古川壮一(日本大学 生物資源科学部 食品微生物学研究室 准教授)
酵母とLactobacillus plantarum に属する乳酸菌の共培養によって担体表面に形成さ
れる複合バイオフィルムは,両菌の細胞接着によって形成される特異な微生物構造体であ
り,担体から剥がれにくく,雑菌排除能に優れ,固定化菌体として連続発酵などによる物
質生産への利用が期待される。
【目次】
1.はじめに
2.酵母?乳酸菌複合バイオフィルムの発見
3.複合バイオフィルムの形成機構
4.固定化菌体としての特徴
5.複合バイオフィルムを利用した半連続発酵
6.複合バイオフィルムの雑菌排除能
7.複合バイオフィルムを利用した連続発酵
8.複合バイオフィルムを利用したシステムの将来展望
-------------------------------------------------------------------------
シナモン抽出物を用いた高強度生物模倣接着剤の開発
Development of Biomimetic Strong Adhesives from a Component of Cinnamon
-------------------------------------------------------------------------
絹川翔悟(九州工業大学 大学院物質工学研究系応用化学部門 高分子先端材料研究室)
金子大作(九州工業大学 大学院物質工学研究系応用化学部門 高分子先端材料研究室 准教授)
筆者らはシナモン抽出物から高い接着力と高い生体安全性を持つ生物模倣接着剤を開発
した。本稿ではこの接着剤の開発過程,接着剤の接着特性・生体安全性,この接着剤の将
来に向けた応用について説明する。
【目次】
1.はじめに
2.ムール貝の接着の仕組み
3.ムール貝の接着を模倣した接着剤の合成
4.Poly(DHCA-co-4HCA)の接着特性の検証
5.より強力な接着剤を作るためにモノマーを変更
6.Poly(DHHCA-co-3HPPA) の細胞毒性の検証
7.骨・歯用接着剤への応用に向けて
8.Poly(DHHCA-co-3HPPA) は骨形成を阻害しないか
9.おわりに
-------------------------------------------------------------------------
イオンビーム育種技術による清酒酵母の開発
Ion Beam Breeding of“Sake Yeast”
-------------------------------------------------------------------------
増渕 隆(群馬県立群馬産業技術センター バイオ・食品係 独立研究員)
佐藤勝也(()独日本原子力研究開発機構 量子ビーム応用研究部門 医療・バイオ応用量子
ビーム技術研究ユニット 研究副主幹)
鳴海一成(東洋大学 生命科学部 生命科学科 教授)
上山 修(群馬県立群馬産業技術センター 研究調整官)
清酒酵母の新しい育種法として炭素イオンビーム照射による変異処理を行い,吟醸香
(カプロン酸エチル)生成量が高く,特徴的な甘い香り傾向を示す酵母を得ることができ
た。新酵母は群馬県内の酒造蔵による実用化試験を経て,平成24 年度より新たな吟醸酵
母として製品に使用されている。本稿では変異誘発から試験醸造までの育種の過程を紹介
する。
【目次】
1.はじめに
2.清酒酵母育種の方向性
3.イオンビーム育種技術の特徴
4.清酒酵母へのイオンビーム照射
4.1 ビーム照射用試料の調製
4.2 ビーム照射条件
5.カプロン酸エチル高生成株の選抜
5.1 セルレニン耐性株の取得
5.2 発酵試験による一次選抜
5.3 小仕込み試験による二次選抜
5.4 小仕込み試験結果
6.小規模醸造試験
6.1 小規模醸造試験の意義
6.2 仕込み配合と原料処理・醪管理目標
6.3 小規模醸造試験結果
6.4 小規模醸造試験結果(平成22 年度)
7.実製造規模試験および製品化
8.今後の展望
-------------------------------------------------------------------------
網羅的解析によるタンパク質凝集特性とシャペロン機能の解明
Comprehensive Analyses of Protein Aggregation and Molecular Chaperones
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丹羽達也(東京工業大学 大学院生命理工学研究科 助教)
田口英樹(東京工業大学 大学院生命理工学研究科 教授)
タンパク質の凝集形成はありふれた現象であるが,どんなタンパク質が凝集しやすい
か,どのシャペロンがどんなタンパク質の凝集を抑制するかについてはよくわかっていな
い。本稿ではシャペロンを含まない無細胞タンパク質合成系を用いて数百・数千種類のタ
ンパク質を一様に調べることでみえてきたタンパク質の凝集性とシャペロンの効果につい
て解説する。
【目次】
1.はじめに
2.再構築型の無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質凝集の網羅解析
3.主要な分子シャペロンによるタンパク質の凝集抑制効果の網羅解析
3.1 DnaKJE,GroEL/ES は様々な種類のタンパク質に作用
3.2 DnaKJE,GroEL/ES の「好み」の違いと重複性
3.3 複数種類のシャペロンを共存させた場合の凝集抑制効果
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ペプチド系溶解性向上タグ「SEP タグ」を用いたタンパク質の凝集の解析および制御
Controlling and Analyzing Protein Solubility Using SEP-Tags
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黒田 裕(東京農工大学 大学院工学研究院 生命機能科学部門)
溶解性はタンパク質の重要な性質であるが,その物理化学的な解析はほとんど進められ
ていない。本稿ではタンパク質の溶解性を親水性・疎水性と異なる視点から議論し,アミ
ノ酸の相対的な溶解性(溶解傾向性)の測定について述べる。さらに,溶解傾向性を用い
た低分子量のペプチド系溶解性向上タグ(SEP タグ)の設計と,その応用例を紹介する。
SEP タグは,タンパク質の構造および活性を害することなく,溶解性のみを制御するこ
とができる汎用的な技術として実用化が期待される。
【目次】
1.はじめに
2.アモルファス凝集の物理化学的解析
2.1 アミノ酸の溶解傾向性とタンパク質の溶解性の研究
2.2 SEP タグ付加による溶解性・凝集性の測定
3.SEP タグを用いた溶解性制御の応用例
3.1 封入体形成防止
3.2 NMR 試料の高濃度化
3.3 SEP タグによる複数SS 結合を形成する組換えタンパク質の収率向上
4.おわりに
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タンパク質の溶解性を操るタンパク質カチオン化技術
Manipulation of Protein Solubility by Protein Cationization Techniques
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二見淳一郎(岡山大学 大学院自然科学研究科 化学生命工学専攻 准教授)
ヒト細胞内タンパク質など不安定で凝集しやすい物性のタンパク質の取り扱いは容易で
はない。変性タンパク質の凝集と不溶化の主因は分子間の疎水相互作用とSS 結合の形成
であるが,これを解決するカチオン化法は,変性状態のタンパク質を水溶性として自由自
在に取り扱うことを可能とする技術である。
【目次】
1.はじめに
2.変性タンパク質の溶解性:疎水性と電荷の関係
3.変性状態のタンパク質のカチオン化による可溶化
4.変性状態のカチオン化タンパク質の活用法
5.可逆的変性カチオン化タンパク質のin cell folding 法
6.おわりに
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難水溶性分子の溶解性を改善するアルギニン
Arginine Improves Solubility of Water-insoluble Molecules
-------------------------------------------------------------------------
井上直人(筑波大学 大学院数理物質科学研究科)
白木賢太郎(筑波大学 数理物質系 准教授)
アルギニンは低分子化合物からタンパク質まで,さまざまな分子の溶解性を改善するこ
とが知られている。しかもアルギニンは,安定で安全で安価な,ありふれたアミノ酸の一
種である。本稿では,バイオテクノロジーや基礎科学,医用などへのアルギニンの応用例
について紹介する。
【目次】
1.はじめに
2.難水溶性化合物の溶解性
3.タンパク質の溶解性
4.高濃度のタンパク質溶液
5.アルギニンの分子機構
6.おわりに
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新規巻き戻し法による標的タンパク質の調製―完全変性を経由しない巻き戻し法―
Direct Protein Preparation from Inclusion Bodies Bypassing Completely-denatured Form
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梅津光央(東北大学 大学院工学研究科 准教授)
谷 泉(東北大学 大学院工学研究科 客員教授)
不溶性顆粒からタンパク質を再活性させるためには,完全変性の状態で可溶化させた後
に天然構造へ誘導させる必要がある。筆者らは,大腸菌発現で形成した不溶性顆粒中には
天然構造に類似な巻き戻り中間体が存在することを突き止めた。本章では,その中間体構
造を利用したタンパク質再活性法を紹介する。
【目次】
1.はじめに
2.不溶性顆粒中のタンパク質は構造をとっていないのか?
3.フォールディングを壊さずに可溶化できるか?
4.フォールディングを壊さずに可溶化できるか?―L-アルギニンの利用―
5.ダイレクトタンパク質調製法の最適化と汎用性
6.さいごに
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共発現による封入体化発現法を用いた組換えペプチド生産
Production of Recombinant Peptides as Inclusion Body by Coexpression
-------------------------------------------------------------------------
相沢智康(北海道大学 大学院先端生命科学研究院 准教授)
組換えペプチドの生産を効率的に行うことは,研究から産業応用までの幅広い分野で重
要な課題である。本稿では,共発現により効率的に封入体形成を促進する手法により,分
解や毒性を回避して効率よく組換えペプチドを生産する手法について,抗菌ペプチドの生
産を例として紹介する。
【目次】
1.はじめに
2.抗菌ペプチドの組換え生産の問題点
3.封入体形成パートナータンパク質との共発現によるペプチド生産
4.まとめ
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封入体タンパク質の高効率回収および活性化技術の開発
Novel Method for Highly Efficient Production and Refolding of
Recombinant Proteins from Bacterial Inclusion Body
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笹平 俊(松本微生物研究所 研究開発担当 専務取締役)
遺伝子組換え大腸菌の発現系を用いて,ブリ成長ホルモン(ブリGH)の生産,封入体
の回収,巻き戻しについて検討した。ブリGH 封入体は培養液1 L 当たり約150mg 生産
され,それから130mg 弱の活性型ブリGH が得られた。これは,従来技術の100 倍以上
の生産量であると共に,本方法は他の封入体タンパク質の可溶化や活性化にも応用できる。
【目次】
1.はじめに
2.組換え大腸菌が生産した封入体の回収方法
2.1 弊社での組換え体の作製・評価
2.2 ブリGH の遺伝子を組み込んだ組換え大腸菌の作製
2.2.1 ブリGH 遺伝子の合成
2.2.2 大腸菌への組込み
2.2.3 組換え大腸菌により生産された目的タンパク質の発現の確認
2.2.4 超音波破砕装置による菌体破砕と菌体由来タンパク質の除去効果
2.2.5 変性剤処理による封入体タンパク質の回収効果
3.リフォールディング方法の開発
3.1 従来技術
3.2 弊社が開発した高効率リフォールディング技術によるリフォールディング
3.2.1 変性剤の選定
3.2.2 開発透析装置による可溶化GH からの巻き戻し反応の効率化
3.2.3 タンパク質量と回収率
3.2.4 前処理およびリフォールディング条件の最適化によるGH の精製
3.2.5 ブリGH 以外のタンパク質生産
4.今後の展開
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BIOR&D
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酵母-乳酸菌複合バイオフィルムの特性と利用
Yeast-Lactic Acid Bacteria Mixed-species Biofilm:Properties and Application
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森永 康(日本大学 生物資源科学部 食品微生物学研究室 教授)
古川壮一(日本大学 生物資源科学部 食品微生物学研究室 准教授)
酵母とLactobacillus plantarum に属する乳酸菌の共培養によって担体表面に形成さ
れる複合バイオフィルムは,両菌の細胞接着によって形成される特異な微生物構造体であ
り,担体から剥がれにくく,雑菌排除能に優れ,固定化菌体として連続発酵などによる物
質生産への利用が期待される。
【目次】
1.はじめに
2.酵母?乳酸菌複合バイオフィルムの発見
3.複合バイオフィルムの形成機構
4.固定化菌体としての特徴
5.複合バイオフィルムを利用した半連続発酵
6.複合バイオフィルムの雑菌排除能
7.複合バイオフィルムを利用した連続発酵
8.複合バイオフィルムを利用したシステムの将来展望
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シナモン抽出物を用いた高強度生物模倣接着剤の開発
Development of Biomimetic Strong Adhesives from a Component of Cinnamon
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絹川翔悟(九州工業大学 大学院物質工学研究系応用化学部門 高分子先端材料研究室)
金子大作(九州工業大学 大学院物質工学研究系応用化学部門 高分子先端材料研究室 准教授)
筆者らはシナモン抽出物から高い接着力と高い生体安全性を持つ生物模倣接着剤を開発
した。本稿ではこの接着剤の開発過程,接着剤の接着特性・生体安全性,この接着剤の将
来に向けた応用について説明する。
【目次】
1.はじめに
2.ムール貝の接着の仕組み
3.ムール貝の接着を模倣した接着剤の合成
4.Poly(DHCA-co-4HCA)の接着特性の検証
5.より強力な接着剤を作るためにモノマーを変更
6.Poly(DHHCA-co-3HPPA) の細胞毒性の検証
7.骨・歯用接着剤への応用に向けて
8.Poly(DHHCA-co-3HPPA) は骨形成を阻害しないか
9.おわりに
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イオンビーム育種技術による清酒酵母の開発
Ion Beam Breeding of“Sake Yeast”
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増渕 隆(群馬県立群馬産業技術センター バイオ・食品係 独立研究員)
佐藤勝也(()独日本原子力研究開発機構 量子ビーム応用研究部門 医療・バイオ応用量子
ビーム技術研究ユニット 研究副主幹)
鳴海一成(東洋大学 生命科学部 生命科学科 教授)
上山 修(群馬県立群馬産業技術センター 研究調整官)
清酒酵母の新しい育種法として炭素イオンビーム照射による変異処理を行い,吟醸香
(カプロン酸エチル)生成量が高く,特徴的な甘い香り傾向を示す酵母を得ることができ
た。新酵母は群馬県内の酒造蔵による実用化試験を経て,平成24 年度より新たな吟醸酵
母として製品に使用されている。本稿では変異誘発から試験醸造までの育種の過程を紹介
する。
【目次】
1.はじめに
2.清酒酵母育種の方向性
3.イオンビーム育種技術の特徴
4.清酒酵母へのイオンビーム照射
4.1 ビーム照射用試料の調製
4.2 ビーム照射条件
5.カプロン酸エチル高生成株の選抜
5.1 セルレニン耐性株の取得
5.2 発酵試験による一次選抜
5.3 小仕込み試験による二次選抜
5.4 小仕込み試験結果
6.小規模醸造試験
6.1 小規模醸造試験の意義
6.2 仕込み配合と原料処理・醪管理目標
6.3 小規模醸造試験結果
6.4 小規模醸造試験結果(平成22 年度)
7.実製造規模試験および製品化
8.今後の展望
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