はじめに 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　工藤俊章,大熊盛也

第1編　難培養微生物の研究方法
第1章　海洋性VBNC微生物とその検出方法 　　　　　　　　　　　　　　木暮一啓
　1.天然水界中の細菌群集　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・3
　2.“休眠細胞”はいない　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・4
　3.なぜ培養できないのか　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・4
　4.今後どれだけの細菌が培養できるか　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・6
　5.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・8

第2章　難培養性微生物の具体例,共生細菌
　　　　　Symbiobacterium thermophilum　　　　　　　　　　上田賢志,別府輝彦
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・10
　2.トリプトファナーゼ生産菌の探索　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・10
　3.S.thermophilumが示す新しい分類学的性質　・・・・・・・・・・・・12
　4.普遍的なSymbiobacterium属細菌　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・15
　5.透析を利用したS.thermophilumの純粋培養　・・・・・・・・・・・・15
　6.Bucillusの役割は環境を整えること　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・17
　7.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・18

第3章　複合微生物系の難培養微生物新規分離手法と複合微生物系有効活用利用法
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　倉根隆一郎
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・20
　　1.1　現在ハンドリング出来る微生物種などには限界がある
　　1.2　未知の微生物を求めて新大陸の複合生物系へ
　　1.3　複合生物系プロジェクト
　2.ゲルマイクロドロップ・フローサイトメトリー法による難培養微生物の新規分離培養法の開発　・・・22
　　2.1　難培養性微生物の分離
　　2.2　分離・培養した微生物の性質
　　2.3　まとめ
　3.複合系微生物機能解析探索自動化システム(HTS; High Throughput Screening)の開発・・・26
　　3.1　複合微生物系機能解析システム
　　3.2　複合生物系由来の新規整理活性物質の探索
　　3.3　まとめ
　4.蛍光消光等分子間相互作用を利用した複合生物系の迅速検出法の開発・・・27
　　4.1　蛍光消光現象を利用した特定遺伝子検出
　　4.2　複合微生物系への適用
　　4.3　まとめ
　5.石油系化合物分解微生物コンソーシアの培養制御技術の開発・・・29
　　5.1　石油分解微生物コンソーシアの機能強化・向上技術
　　5.2　フェノール分解微生物コンソーシアの培養制御技術の開発
　6.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・31

第4章　環境サンプルの16S rDNAクローン解析法とT-RELP解析法 　　本郷裕一
　1.16SrDNA解析の目的　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・33
　2.16SrDNAクローン解析　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・33
　　2.1　DNA抽出
　　2.2　PCR増幅
　　2.3　クローンライブラリーの作成とインサートチェック
　　2.4　配列決定とphylotypeへの分類,キメラ判定
　　2.5　系統解析
　　2.6　多様性の評価
　　2.7　群集構造の比較
　　2.8　クローン解析における問題点
　3.T-RELP解析　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・41
　　3.1　DNA抽出とPCR増幅
　　3.2　制限酵素処理
　　3.3　データ解析と問題点

第5章　キノンをバイオマーカーとして用いる環境微生物群集の解析 　平石　明
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・45
　2.キノンの分布とバイオマーカーとしての意義　・・・・・・・・・・・・・・46
　3.キノン分析法　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・50
　4.キノン分析の応用　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・51
　5.データ解釈および数量解析　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・53
　6.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・55

第6章　定量的PCR法を用いた難培養微生物のモニタリング 　　　　　金川貴博,蔵田信也
　1.定量的PCR法の概要　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・57
　2.リアルタイム定量的PCR法　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・57
　　2.1　DNA結合性蛍光色素を用いる手法
　　2.2　蛍光標識プローブを用いる手法
　　　2.2.1　FRETを利用する蛍光標識プローブ
　　　2.2.2　蛍光色素と塩基との相互作用による蛍光消光を利用するプロ-ブ
　　2.3　蛍光標識プライマー法
　3.内部標準PCR法　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・66
　4.競合的PCR法　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・66
　5.MPN-PCR法　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・67
　6.定量的PCR法の難培養微生物定量への応用　・・・・・・・・・・・・67

第7章　難培養微生物のin situ検出法 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　山口進康,那須正夫
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・69
　2.微生物の現存量測定法　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・69
　3.生きている微生物の検出・定量　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・70
　　3.1　蛍光活性染色法
　　3.2　DVC(Direct viable count)法
　　3.3　マイクロコロニー法
　4.特定の微生物の検出・定量　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・74
　　4.1　蛍光抗体法
　　4.2　蛍光in situハイブリダイゼーション(Fluorescence in situ hybridization; FISH)法
　　4.3　in situ PCR法
　5.省力化・自動化　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・79
　6.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・81

第8章　機能遺伝子による解析とその検出 　　　　　　　　　　　　　　　野田悟子,大熊盛也
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・83
　2.環境中の機能集団の検出　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・83
　3.環境中の機能遺伝子のmRNAの検出　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・85
　4.モニタリングとsingle cell levelでの検出　・・・・・・・・・・・・・・・・・・86
　5.窒素固定細菌の検出と解析例　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・87
　　5.1　シロアリ共生系の窒素固定に関わる微生物の解析
　　5.2　海洋の窒素固定に関わる微生物の解析　・・・・・・・・・・・・・90
　6.硝化と脱窒に関わる微生物の解析例　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・90
　7.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・91

第9章　DNAマイクロアレイを用いた環境サンプル中の微生物群集の解析
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　江崎孝行,大楠清文,河村好章
　1.系統マイクロアレイの作成　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・94
　2.土壌のDNAの抽出　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・95
　3.遺伝子増幅　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・96
　4.マイクロアレイとの反応　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・98
　　4.1　結果の解析方法
　　　4.1.1　病原体および特定の機能を持った菌群のScreenig
　　　4.1.2　優位な菌の系統解析
　　　4.1.3.菌種レベルの解析
　4.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・100

第2編　自然環境中の難培養微生物
第1章　メタン生成古細菌と嫌気共生細菌
　　　　　-嫌気性廃水処理プロセスを例に-　　　　　　　　　　　　　　　　　　関口勇地,鎌形洋一
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・103
　2.嫌気環境下の微生物　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・103
　3.嫌気的有機物分解-嫌気共生細菌とメタン生成古細菌との共生-・・・106
　　3.1　メタン生成古細菌
　　3.2　共生細菌
　　3.3　その他の微生物
　4.嫌気性廃水処理プロセス　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・109
　　4.1　嫌気性廃水処理プロセスにおける各種共生細菌
　　4.2　グラニュール汚泥の構造を決定する糸状性細菌
　　4.3　それ以外の未培養微生物群とそれらを解析するためのアプローチ
　5.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・114

第2章　環境中の多様な石油分解菌 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　渡辺一哉
　1　はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・116
　2　多様な石油分解菌を単離する試み　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・117
　　2.1　標識基質を用いた直接プレート法
　　2.2　連続培養集積法
　　2.3　生物膜集積法
　3.より多様な石油分解菌を理解するために　・・・・・・・・・・・・・・・・120
　　3.1　中間代謝産物シェア
　　3.2　分解促進因子
　　3.3　細胞間シグナリング物質
　4.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・123

第3章　有機性廃棄物の生分解処理と難培養微生物 　　　　　　　　　　春田　伸,五十嵐泰夫
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・125
　2.培養法基づく微生物研究　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・125
　3.有機物分解過程への分子生物学的手法の適用　・・・・・・・・・・126
　4.培養を経ない手法による微生物の検出　・・・・・・・・・・・・・・・・・127
　5.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・130

第4章　深海極限環境における微生物学的多様性と難培養性微生物　 加藤千明,荒川　康
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・132
　2.深海のコールドシープ域における微生物学的多様性と難培養性微生物　・・・134
　　2.1　コールドシープ低泥サンプルの回収と分子生態学的解析
　　2.2　バクテリアにおける微生物学的多様性解析
　　2.3　アーキアにおける微生物学的多様性の特徴
　　2.4　コールドシープ環境におけるイオウ循環モデル
　　2.5　コールドシープ環境の硫酸還元細菌
　3.本当に難培養性?まだ培養に成功してないだけ?　・・・・・・・・145
　4.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・146

第5章　家畜と難培養微生物-家畜消化管内微生物研究の最前線- 　竹中昭雄
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・148
　2.培養によらない細菌の検出　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・149
　3.家畜消化管細菌の分子系統解析　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・150
　4.ルーメン内難培養性微生物への分子生物学手法の応用　・・・153
　5.人工ルーメンとメタゲノム解析・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・154

第6章　難培養微生物を含むヒト口腔内細菌叢の解析 　　　　　　　　　坂本光央,辨野義己
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・157
　2.ヒト口腔スピロヘータ　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・158
　3.歯周病原性細菌の検出・定量　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・159
　4.口腔内の微生物群集の構造　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・159
　5.新規口腔内西院(ファイロタイプ)の検出　・・・・・・・・・・・・・・・・・161
　6.微生物群集構造解析の新たなアプローチ　・・・・・・・・・・・・・・・・161
　7.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・163

第7章　難培養性細菌を含むヒトの大腸内細菌叢の解析　　　　　　　　林　秀謙,辨野義己
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・165
　2.16SrRNA遺伝子ライブラリー解析　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・165
　3.16SrRNA遺伝子を使用したフィンガープリンティングによる大腸内細菌叢の解析・・・168
　4.Fluorescent in situ hybridization(FISH)による大腸内細菌叢の解析・・・170
　5.特異的プライマーによる検出　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・170
　6.機能遺伝子による大腸内細菌叢の解析　・・・・・・・・・・・・・・・・・171
　7.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・172

第8章　昆虫の細胞内共生微生物 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　中鉢　淳,石川　統
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・174
　2.菌細胞内共生系　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・175
　　2.1　菌細胞内共生系と栄養要求
　　2.2　アブラムシの共生細菌Buchnera aphidicola
　　2.3　Buchneraゲノムの特徴
　　2.4　一次共生体と二次共生体
　　2.5　WigglesworthiaとBlochmanniaのゲノム
　　2.6　今後注目される菌細胞内共生菌
　　2.7　宿主菌細胞の役割
　3.ゲスト微生物　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・181
　　3.1　Wolbachia pipientisによる宿主の生殖撹乱
　　3.2　Wolbachiaゲノム
　4.まとめと展望　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・183

第9章　絶対共生微生物・アーバスキュラー菌根菌 　　　　　　　　　　　斎藤雅典
　1.アーバスキュラー菌根菌とは何か?　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・186
　2.アーバスキュラー菌根(AM)菌のライフサイクル　・・・・・・・・・・・186
　3.アーバスキュラー菌根(AM)菌はなぜ培養できないか?　・・・・187
　4.アーバスキュラー菌根(AM)菌の機能解明:遺伝子からアプローチする・・・189
　5.アーバスキュラー菌根(AM)菌機能解明:顕微鏡によるアプローチ・・・・・・190
　6.遺伝子源としてのアーバスキュラー菌根菌　・・・・・・・・・・・・・・・191

第10章　植物の内生窒素固定細菌 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　南澤　究
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・193
　2.根粒菌の生活環　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・193
　3.根粒バクテロイドの難培養性　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・195
　4.根粒菌の共生モードから単生モードへの切り換えの意味　・・・・197
　5.イネ科植物体内の窒素固定エンドファイト　・・・・・・・・・・・・・・・・198
　6.野生のイネ科植物の分離困難な窒素固定細菌共同体　・・・・・198
　7.植物体内で培養困難になるAzoarcus属窒素固定エンドファイト・・199

第3編　微生物資源としての難培養微生物
第1章　eDNAによる培養困難微生物資源へのアクセス 　　　　　　　　長谷部　亮
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・203
　2.eDNA,メタゲノム解析とは　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・203
　3.eDNAとメタゲノム解析による研究実績と内外の研究動向・・・・204
　　3.1　新規酵素探索
　　　3.1.1　多糖類分解酵素
　　　　　　　(1) セルラーゼ
　　　　　　　(2) キシラナーゼ
　　　　　　　(3) キチナーゼ
　　　　　　　(4) アガラーゼ
　　　　　　　(5) アミラーゼ
　　　3.1.2　アルコール,有機酸分解酵素
　　　　　　　(1) アルコール酸化還元酵素
　　　　　　　(2) 酪酸分解酵素
　　　3.1.3　脂質分解酵素
　　　　　　　(1)　リパーゼ
　　　3.1.4　タンパク質分解酵素
　　　　　　　(1)　アルカリプロテアーゼ
　　　3.1.5　分解性有機化合物分解酵素ほか
　　3.2　新規生理活性物質探索
　4.eDNA研究の技術的課題　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・208
　　4.1　塩基配列ベース研究(eDNA-PCR研究)
　　4.2　発現ベース研究
　　　4.2.1　eDNA回収法:できるだけマイルドに大きなサイズのDNA断片を得る
　　　4.2.2　BACライブラリーの利用:より大きなDNA断片をクローニングする
　　　4.2.3　進むBACベクターの改良:大腸菌以外の宿主で発現させる
　　　4.2.4　スクリーニング効率を上げる
　5.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・211

第2章　難培養性真核微生物のEST解析
　　　　　-シロアリ腸内の絶対共生性原生生物をモデルとして- 　　　　守屋繁春
　1.「培養されていない」微生物から遺伝子資源を探す　・・・・・・・・214
　2.環境cDNAライブラリー　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・215
　3.シロアリの共生原生生物　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・215
　4.微生物集団からのcDNAライブラリー構築の実際　・・・・・・・・・・216
　5.シロアリ腸内共生原生生物群のEST解析　・・・・・・・・・・・・・・・・219
　6.環境cDNAライブラリー的アプローチの問題と将来　・・・・・・・・・・222

第3章　難培養微生物をいかに系統保存化するのか? 　　　　　　　　辨野義己,伊藤 隆
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・224
　2.難培養微生物とその分離培養法　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・225
　3.牛ルーメン内難培養偏性嫌気性菌の単離・培養　・・・・・・・・・・226
　4.ヒト口腔内難培養トリポネーマの単離・培養法の確立　・・・・・・229
　5.好熱性古細菌の分離・培養　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・229
　6.難培養性微生物の系統保存　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・232
　7.難培養性原核生物の命名　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・233
　8.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・242

第4章　難培養性微生物からの生物活性天然物質の探索 　　　　　　作田庄平
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・237
　2.eDNAを用いた放線菌のタイプ?U型ポリケチド生合成遺伝子の多様性解析・・・238
　3.eDNA由来の生合成遺伝子を利用した天然物質の生産　・・・・・239
　4.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・242

第5章　海綿由来の生理活性物質と共生微生物 　　　　　　　　　　　　伊藤卓也,小林資正
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・244
　2.海洋生物由来の医薬品資源　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・245
　3.生物活性物質を生産する共生微生物の存在　・・・・・・・・・・・・・247
　4.海洋微生物からの生物活性物質　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・249
　　4.1　分離例1
　　4.2　分離例2
　　4.3　分離例3
　　4.4　分離の応用
　5.バイオテクノロジー技術を用いた培養生共生微生物の利用・・・251
　6.おわりに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・253

第6章　醸造にかかわる難培養・複合系微生物 　　　　　　　　　　　　北垣浩志,北本勝ひこ
　1.はじめに　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・255
　2.醸造における複合系微生物　・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・255
　　2.1　清酒
　　　2.1.1　酒母
　　　　　　　(1) きもと系酒母
　　　　　　　(2) 菩提もと
　　　　　　　(3) 速醸系酒母
　　　2.1.2　もろみ
　　　2.1.3　貯蔵
　　2.2　焼酎
　　2.3　ビール
　　2.4　ランビックビール
　　2.5　ウィスキー
　　2.6　ワイン
　　2.7　シェリーワイン
　3.おわりに